導讀：藥物研發(fā)一直是個(gè)繁瑣的過(guò)程，化學(xué)家們需要篩選千百種化學(xué)分子，才可能找出有效的藥物。DNA技術(shù)可以大大加快這一過(guò)程。過(guò)去幾年來(lái)，藥物化學(xué)家通過(guò)用DNA標記化學(xué)分子，形成分子的二維碼，從而提高藥物研發(fā)成功率。

　　麻省沃爾瑟姆市(Waltham, Massachusetts)的一座鋼筋混泥土建筑的二樓，一個(gè)實(shí)驗室冰箱里的塑料盒中，包含著(zhù)無(wú)數種化學(xué)分子。這些分子是葛蘭素史克制藥公司(GlaxoSmithKline，GSK)合成的帶DNA標簽的分子，數目達到萬(wàn)億種——這是銀河系恒星數目的10倍。

　　各大制藥公司和生物工程公司都在采用這種DNA編碼分子庫來(lái)迅速篩選能與疾病相關(guān)蛋白結合的分子，尤其是能與那些目前難以靶向的蛋白結合的藥物。這種篩選方法比傳統篩藥方式更迅速，更便宜?；A科學(xué)研究者也可以使用這種方法來(lái)探索基本生物學(xué)問(wèn)題，研究酶、受體和細胞通路。

　　藥物研發(fā)的起始步驟往往是：研究人員合成大量化學(xué)分子，然后測試這些分子對目標蛋白的結合作用。在多孔板的每個(gè)孔里加入目標蛋白，然后分別加入各種藥物分子，檢測這些分子對蛋白活力的影響。這種方法被稱(chēng)為高通量篩選(high-throughout screening，HTS)，主要使用機器自動(dòng)測試上百萬(wàn)種化學(xué)分子，但仍然耗時(shí)耗力還費錢(qián)，而且不一定湊效。

　　過(guò)去幾年來(lái)，藥物化學(xué)家通過(guò)用DNA標記化學(xué)分子，形成分子的二維碼，從而提高藥物研發(fā)成功率。這些DNA編碼分子庫具有諸多優(yōu)點(diǎn)：首先，研究者并不需要單獨測試每種分子;而是只需把分子分成各種混合物，然后檢測混合物是否對目標蛋白活性有影響。一旦有分子能與目標蛋白結合，它就很容易被認出來(lái)——因為可以檢測它的DNA二維碼。

　　1992年斯克里普斯研究所(Scripps Research Institute)的分子生物學(xué)家Sydney Brenner 和化學(xué)家 Richard Lerner提出DNA編碼分子庫這一概念。此后，DNA編碼分子庫一直發(fā)展迅猛。2007年，GSK公司以5500萬(wàn)美金收購了一家在DNA標簽分子庫研究站處于地位的公司。瑞士巴塞爾的諾華公司和羅氏公司也建立了內部DNA標簽分子庫研究項目。多家新興生物科技公司——包括沃爾瑟姆的X-chem、哥本哈根的Vipergen、劍橋的Ensemble制藥公司和瑞士的Philochem——也和學(xué)界和工業(yè)界合作，迫切希望使用該技術(shù)。

　　“人們現在明白了，DNA編碼分子庫不是一種時(shí)尚，而是可以實(shí)現的。” 波士頓阿斯利康公司(X-Chem公司的合作者之一)化學(xué)創(chuàng )新中心的執行理事Robert Goodnow這樣說(shuō)到。

　　DNA編碼分子庫不會(huì )取代高通量篩選：由于一些化合物不能使用DNA編碼技術(shù)合成，各大公司已在高通量篩選上投入巨資。但DNA編碼分子庫提供了一個(gè)快速有效、低成本的互補方案，幫助尋找與新的或具有挑戰性的目標蛋白結合的分子。例如，尋找泛素連接酶——一種將泛素分子連接到目標蛋白的酶、可作為癌癥治療的靶向分子——的結合分子。

圖：建立DNA二維碼

　　大即是美

　　GSK目前擁有世界上zui大的DNA編碼分子庫：GSK的高通量篩選庫有200萬(wàn)種分子，而DNA編碼分子庫有1萬(wàn)億種分子，是高通量篩選庫的50萬(wàn)倍。

　　建立DNA編碼庫有幾種方式：zui大的分子庫，如GSK公司，使用 DNA記錄法(圖：建立DNA二維碼)。首先合成化學(xué)構建模塊，如氨基酸、胺和羧酸，然后通過(guò)化學(xué)反應，為它們添加不同的DNA二維碼。將第二個(gè)建構模塊加入到混合物中，形成新的小分子，DNA標簽延長(cháng)。通過(guò)連接4個(gè)構建模塊，化學(xué)家可創(chuàng )造藥物分子。由于建筑模塊的種類(lèi)有上千種，因此潛在的組合數目非常巨大。

　　與傳統高通量篩選相比，化學(xué)家必須單獨對每個(gè)化合物進(jìn)行檢測，而DNA編碼庫更易于維護和使用。DNA編碼庫可以存儲在一個(gè)單一測試管中，而高通量篩選需要使用機器人把每個(gè)分子單獨放到一個(gè)測試管中。

　　但GSK的Chris Arico-Muendel表示，DNA編碼庫zui大的優(yōu)點(diǎn)，是可合成的分子數量多。對于新或難的目標蛋白，GSK使用DNA編碼庫和高通量篩選的頻率相同，甚至更高。迄今為止，GSK公司使用DNA編碼技術(shù)合成的化合物是GSK2256294，能有效阻斷環(huán)氧化物酶，一種參與脂肪分解的酶。該候選藥物是Praecis和GSK的合作成果，已通過(guò)1期臨床安全實(shí)驗，將進(jìn)一步評估其在糖尿病、傷口愈合和慢性阻塞性肺病的治療中的效果。Arico-Muendel表示，他們很高興，GSK的DNA編碼庫能發(fā)展這么順利。

　　隨著(zhù)化學(xué)構建模塊的增多，以及連接方式的增多，DNA編碼庫還會(huì )進(jìn)一步擴大。

　　X-Chem執行官Richard Wagner則認為，在不久的將來(lái)，DNA編碼庫不僅變得更大，也能更快進(jìn)入臨床。傳統的藥物篩選中，藥物化學(xué)家有時(shí)要花許多年來(lái)調整化合物結構，讓它們更特異、強效和安全。Wagner表示，可以說(shuō)，傳統篩藥只是一場(chǎng)概率游戲。相比之下，基因編碼庫的大尺寸意味著(zhù)，按照概率計算，一些化合物更易進(jìn)入臨床。盡管這些化合物仍然需要優(yōu)化，但更接近理想分子，需要調整的幅度更小。

　　X-Chem的DNA編碼庫有1200億種化合物，并已開(kāi)始進(jìn)行實(shí)踐。僅僅過(guò)了一年，他們就篩選出了候選藥物——一種autotaxin抑制劑，能阻斷一種磷脂轉化成另一種磷脂。X-Chem的子公司X-Rx現在計劃在2017年開(kāi)始纖維變性藥物的臨床試驗。業(yè)界對X-Chem的DNA編碼分子庫的興趣日益高漲：在過(guò)去五年中，該公司已與幾大制藥*，包括羅氏、阿斯利康、拜耳、強生、輝瑞、賽諾菲等簽署合作協(xié)議，此外還和多個(gè)生物工程公司和學(xué)術(shù)實(shí)驗室建立合作。

　　定制合成

　　其他生物公司則采用另一種方法合成分子庫。他們不僅使用DNA標簽來(lái)標記分子，也使用DNA標簽作為合成模板。哈佛大學(xué)(Harvard University)的化學(xué)家David Liu和他的學(xué)生開(kāi)發(fā)了一種DNA模板法，產(chǎn)生環(huán)形分子庫。環(huán)狀分子更大、更穩定，能在多個(gè)位點(diǎn)與目標分子結合，增強結合反應的特異性。(GSK和X-Chem公司都有很大的DNA編碼環(huán)形分子庫。)

圖為Sydney Brenner，與Richard Lerner在1992年提出DNA編碼分子庫的概念。

　　Liu首先產(chǎn)生單鏈DNA模板，模板包含與化學(xué)構建模塊的DNA標簽互補的序列。然后依次往化學(xué)反應容器中加入DNA標記的化學(xué)構建模塊，依靠DNA堿基配對，使各個(gè)構建模塊的DNA標簽與DNA模板結合。zui后的反應是將各個(gè)化學(xué)構建模塊連接成環(huán)狀，產(chǎn)生環(huán)形分子和一個(gè)長(cháng)鏈DNA標簽。

　　構建DNA模板庫需要大量工作，因為研究人員必須為每個(gè)分子設計模板，還需要為成千上萬(wàn)種化學(xué)構建模塊設計DNA標簽。因此，DNA模板法產(chǎn)生的分子庫小于DNA記錄法產(chǎn)生的分子庫，但依舊遠大于高通量篩選庫，并且還擁有其他優(yōu)點(diǎn)。在DNA模板法中，科學(xué)家們一開(kāi)始就知道zui終合成的分子有哪些，他們可以純化分子庫，去掉那些標簽錯誤的分子。這增加了篩藥的成功率。相比之下，巨大的DNA記錄分子庫可能仍然包含標簽錯誤的化合物。萬(wàn)一標簽錯誤的分子與目標蛋白結合，研究者們就需要浪費大段時(shí)間在糾錯上。

　　Liu的分子庫包含14000種分子，目前已取得一些成功。2014年，他的團隊報道，他們發(fā)現了一種穩定的、特異的胰島素降解酶(insulin-degrading enzyme, IDE，與2型糖尿病有關(guān))小分子抑制劑，在此之前，研究者們花了幾十年尋找和設計IDE抑制劑。Liu等人開(kāi)始研究IDE在健康和疾病中的作用，幫助尋找其它IDE抑制劑。目前他們正努力把小分子抑制劑轉化成臨床藥物。

　　Liu也篩選了100多種目標蛋白的抑制劑。這些蛋白大多急需小分子抑制劑，來(lái)促進(jìn)相關(guān)領(lǐng)域的研究。“我沒(méi)有想到，*代分子庫在7年后的今天，仍然能為我們帶來(lái)這么多科學(xué)發(fā)現。在篩選抑制劑上，我們成果累累。到現在為止，我們發(fā)現了非常多種分子的抑制劑，數目多到我們無(wú)法一一研究。”

　　盡管如此，Liu仍然不懈發(fā)展第二代DNA模板分子庫，這個(gè)分子庫包含256000個(gè)環(huán)形分子。Liu在2004年創(chuàng )立了Ensemble Therapeutics公司，該公司的分子庫現在已有1000萬(wàn)個(gè)分子。公司聚焦于尋找免疫檢查點(diǎn)蛋白的抑制劑，調節免疫系統和泛素連接酶。他還授權給諾華公司，開(kāi)發(fā)靶向炎癥相關(guān)蛋白白細胞介素-17的藥物。

　　快速篩選

　　一旦分子庫建立成功，就開(kāi)始了目標蛋白結合分子的尋找之旅。大多數研究人員依靠“親和篩選”來(lái)找出這些化合物。為此，他們?yōu)榘械鞍滋砑蛹兓瘶撕?，使用純化標簽把結合了分子的蛋白提取出來(lái)。zui后一步是讀取DNA標簽，鑒別與蛋白結合的小分子。

　　這種方法的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，僅需一點(diǎn)點(diǎn)目標蛋白，就能得到結果。在一個(gè)項目中，Arico-Muendel想尋找一種不穩定的、獲取量很少的蛋白的結合分子。他說(shuō)，“把蛋白放在干冰上后，我們很快完成了整個(gè)篩選過(guò)程。而且我們找到了一些能與該蛋白結合的分子。”高通量篩選是無(wú)法完成這種這類(lèi)實(shí)驗。因為高通量篩選里，目標蛋白必須穩定且足量，且要在實(shí)驗開(kāi)始前往千百個(gè)孔里加入目標蛋白。

　　但親和篩選也有其不足。笨重的DNA標簽有時(shí)會(huì )阻礙分子與目標蛋白的互動(dòng)，因此一些有效的分子可能被遺漏。但由于DNA編碼庫太大，研究者們通常不太在意這些損失。更大的問(wèn)題是，小分子和標簽可以結合到純化柱上，產(chǎn)生假陽(yáng)性率。純化標簽也會(huì )影響目標蛋白的結構，引入數據誤差。

　　幾個(gè)研究小組已經(jīng)找到了解決之道。Vipergen，一家擁有5000萬(wàn)個(gè)分子的DNA模板庫的生物技術(shù)公司，采用“粘合劑陷阱”來(lái)解決這個(gè)問(wèn)題。

　　Vipergen公司的執行官Nils Hansen表示，你可以?xún)鼋Y你的蛋白——分子庫混合物，切割成非常小的冰塊。如果冰塊足夠小，每個(gè)冰塊只包含一個(gè)靶蛋白。在這個(gè)尺度上，即使沒(méi)有純化，與該靶蛋白結合的小分子的比例也會(huì )增加。Vipergen在水和油乳劑中完成篩選，也能達到同樣的效果。此時(shí)，微小的水滴的效果等同于小冰塊。Hansen感慨，“這超酷!”

　　目前，DNA編碼分子庫用于篩選可溶于水、自由浮動(dòng)的蛋白的抑制劑。但很多重要的藥物靶點(diǎn)嵌于細胞表面，因此不可能使用傳統的親和篩選法。例如，大約40%的經(jīng)認證藥物的靶點(diǎn)都是細胞膜上感受胞外刺激的G蛋白偶聯(lián)受體。Goodnow指出，膜結合蛋白的篩選技術(shù)在不斷發(fā)展，“但仍然不夠完善”。

　　一種解決方法是混合DNA編碼分子庫與過(guò)表達膜結合蛋白靶標的完整細胞。小分子可以與細胞表面的目標蛋白結合。然后，研究者洗去未發(fā)生結合的分子，加熱細胞，讀取DNA標簽，鑒定有效的小分子。GSK已經(jīng)用這種方法來(lái)確定一個(gè)受體——該受體在精神分裂癥和中樞神經(jīng)系統疾病中起重要作用的強效抑制劑。

　　X-Chem也在膜結合蛋白藥物篩選中獲得成功。Wagner說(shuō)，“以前，我們主要篩選可溶性蛋白的抑制劑。但數據顯示，我們現在也能篩選相對困難的膜結合蛋白的抑制劑。” Wagner補充說(shuō)，隨著(zhù)DNA編碼庫的不斷擴大，以及新的篩選方法的問(wèn)世，“DNA編碼庫將成為醫藥行業(yè)藥物研發(fā)的支柱之一。”

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